Дмитрий Мирошниченко, Михаил Филиппов, Сергей Долгов

Станция «Биотрон», Филиал Института биоорганической химии им.акад. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова, РАН, ул. Институтская 6, г. Пущино, Московской обл.,142290. email: miroshnichenko@fibkh.serpukhov.su

Пшеница (Triticum aestivum L.) является главной зерновой культурой России. Используя методы генетической инженерии исследовательская группа станции «Биотрон», Филиал Института Биоорганической химии РАН, работает над получением новых трансгенных форм пшеницы устойчивых к биотическим и абиотическим факторам. Рассматриваются вопросы от создания эффективной методики переноса генов в геном пшеницы до проведения полевых испытаний трансгенных растений.
Пшеница (Triticum aestivum L.) является главной зерновой культурой России, а наша страна занимает одно из первых мест в мире по производству зерна. Несмотря на огромную потребность в сортах пшеницы устойчивых к различным стрессовым факторам внешней среды, в настоящий момент получить желаемые формы не всегда удается вследствие сложной генетической природы большинства признаков. Тем не менее, прямой перенос небольшого числа генов с заданными свойствами путем генетической трансформации представляет собой быстрый альтернативный путь для создания новых форм устойчивых к биотическим и абиотическим стрессовым факторам.
В настоящий момент наиболее популярным методом переноса генетического материала в геном пшеницы является метод баллистической трансформации. В течение последних пяти лет на станции искусственного климата «Биотрон» (Филиал Института биоорганической химии РАН, Пущино) ведутся работы по разработке эффективной системы соматического эмбриогенеза/генетической трансформации различных яровых и озимых сортов Российской селекции.

Рис 1. Векторы для генетической трансформации пшеницы

Для получения трансгенных растений пшеницы мы использовали несколько векторов, сконструированных для экспрессии гетерологичных генов в геномах злаковых культур (Рис 1): psGFP-BAR (Richards et al. 2001) и pAct1-F (McElroy et al., 1990). Первая конструкция содержит ген gfp с оптимизированным кодоном для экспрессии в растениях, а также ген bar, придающий устойчивость клеткам растений к гербициду Basta (содержит в качестве активного ингредиента L-phosphinotricin). Вторая векторная конструкция содержит репортерный ген gus. Для достижения высокой экспрессии данных генов использовали промотеры+интроны Ubi1 кукурузы (Christensen et al. 1992) и Act1 риса (McElroy et al., 1990).

Рис 2. Отбор трансгенной ткани по экспрессии гена gfp. A. Транзиентная экспрессия гена gfp в тканях экспланта через 24 часа после бомбардировки B. Прямая регенерация трансгенного эмбриона. C. Образование эмбриогенного каллуса с экспрессией гена gfp. D. Формирование трансгенной эмбриона из эмбриогенного каллуса.

Сочетание двух генов gfp и bar позволяло нам вести отбор трансгенной ткани in vivo. Результатом наших экспериментов по оптимизации различных этапов трансформации/селекции стало создание эффективной системы прямого переноса генов, позволяющей сократить до минимума образование нетраснгеных растений-регенерантов («escapes»), образование которых широко распространено при трансформации пшеницы и других злаковых. Оптимизированная двойная система отбора трансгенной ткани позволила нам получить 53 независимых трансгенных линий пшеницы двух сортов Андрос и Норрис.

Рис 3. Экспрессия перенесенных генов в различных тканях пшеницы. A. GUS экспрессия в сегментах стебля и зачаточном колосе. B. Экспрессия гена gfp в молодом колосе. C. Экспрессия гена gfp в пыльниках (верхний пыльник – нетрансгенный).

Успешное наследование и стабильная экспрессия перенесенных генов являются важным условием генетической трансформации злаковых культур. Нами изучено наследование трансгенов в различных поколениях растений Т1-Т3, полученных от самоопыления 22 независимых линий сорта Андрос и 5-ти линий сорта Норис. Для этого незрелые эмбрионы выделяли из зерновок, помещали в условия in vitro и анализировали с использованием флуоресцентного микроскопа (Рис 4). Для выявления экспрессии гена gus, после прорастания эмбрионов проводили гистохимическое окрашивание. В потомстве Т1 большинства из проанализированных линий (19 из 27) наблюдали наследование характерное для однолокусной вставки трансгена (3:1). Однако 8 линий проявляли наследование не характерное для Менделеевского расщепления, варьирующее от 5:1 до 20:1. Подобные отклонения неоднократно описывались в работах по трансформации злаковых культур. Причина такого непрогнозируемого наследования пока до конца ясна. Обычно это связано с нестабильностью перенесенного гена или его молчанием при дальнейшем наследовании вследствие многокопийной вставки в геном растения. После проращивания и адаптации растений поколения Т1 линий проявляющих наследование 3:1 проводили анализ на устойчивость к гербициду в условиях теплиц.

Рис 4. Анализ наследования экспрессии гена gfp в T1 поколении на среде для прорастания зародышей после культивирования в течение одного (A, B) и пяти дней (B, D). A, C – эмбрионы не наследующие трансген, B, D – трансгенные эмбрионы.

После выяснения характера наследования трансгенов мы провели сравнительный тест на устойчивость г гербициду гомозиготных и гетерозиготных растений Т1. Анализ проводили на растениях полученных от самоопыления 17-ти первичных растений независимых линий Т0. Для этого нами была разработана бальная система оценки повреждения гербицидом листьев растений пшеницы (от 0 до 5). Данные исследования показали, что в целом уровень устойчивости у гомозиготных и гетерозиготных растений не отличался. Тем не менее, у двух линий мы наблюдали увеличение устойчивости у гомозиготных растений Т1 по сравнению с гетерозиготными. Следует отметить, что известно мало работ, касающихся различий в экспрессии гомо- и гетерозиготных трансгенных растений. Результаты этих работ достаточно противоречивы. В некоторых работах наблюдалось положительное влияние гомозиготного статуса трансгенного риса на уровень экспрессии (Baruah-Wolff et al, 1999; Duan et al. 1996). В тоже время, в других исследованиях, подобно нашему, такие различия не наблюдались или были статистически не достоверными (Peng et al. 1995; James et al. 2002; Fearing et al. 1997). Для выяснения более полной картины влияния статуса трансгена в растениях пшеницы на эффективность экспрессии, в настоящий момент мы проводим исследования с растениями содержащими несколько гетерологичных генов.

Рис 5. Схема проведения полевых испытаний на устойчивость к гербициду. A, B, C, D – экспериментальные участки, содержащие 18 делянок, на которых рандомизированно расположены траснгенные линии (№№1-16) и два контроля (A, H). Участки B и C обрабатывали гербицидом Basta (1%)

Рис 6. Экспериментальное поле до обработки гербицидом (фаза кущения) (A) и перед уборкой (B), 2004 г.

Одним из важнейших этапов при трансформации злаковых культур являются полевые испытания, призванные выявить реальный эффект от применения методов генетической инженерии. В 2004 году впервые в России мы осуществили полевые испытания Т3 гомозиготных растений полученных от семи независимых трансгенных линий двух сортов Андрос и Норрис. Поскольку большинство основных агрономических характеристик, например урожайность и биомасса, в значительной степени варьируют от факторов внешней среды, эксперимент был осуществлен в нескольких повторностях. Трансгенные и нетраснгенные семена высевали на 18 делянках в четырех повторностях (участках). Анализировали 16 трансгенных семей и два контроля (нетрансгенные Андрос и Норрис). Два участка из четырех обрабатывали гербицидом. Два других служили контролем для выяснения возможных различий в урожайности вследствие обработки гербицидом. Растения пшеницы однократно обрабатывали 1% раствором Basta в фазе кущения. Спустя неделю после обработки большинство трансгенных линий не проявили заметных признаков повреждения, тогда как у нетрансгенных контрольных растений наблюдали гибель надземной массы (Рис 7).

Рис 7. Полевые испытания трансгенных линий пшеницы (гомозиготное поколение Т3) на устойчивость к обработке гербицидом Basta. A. до обработки. B. через неделю после обработки.

Для прояснения эффекта обработки гербицидом и подтверждения сортовой идентичности трансгенных семей, мы изучали следующие характеристики: высота растений, вес семян в одном колосе, число колосьев на м2 и урожайность с м2. Результаты проведенных измерений показали, что урожайность большинства трансгенных и контрольных растений были сравнимы. Тем не менее, две трансгенные семьи из шестнадцати анализируемых проявляли заметные отличия от оригинального сорта (Рис 8). Следует отметить, что эти различия наблюдали не зависимо от того, подвергались ли трансгенные растения этих семей обработке гербицидом или нет. Это указывает на то, что эти различия являются следствием соматоклональных вариаций, произошедших еще в культуре in vitro при регенерации первичных трансгенных растений. В целом, мы не наблюдали статистически достоверной разницы по большинству показателей между необработанными трансгенными/нетрансгенными растениями и обработанными трансгенными растениями. Хотя на различных делянках наблюдалось и уменьшение, и увеличение урожайности. Эти исследования не были направлены на выяснение молекулярных механизмов обуславливающих эффективность экспрессии гетерологичных генов в полевых условиях, однако полученные результаты и накопленный опыт найдут свое применение при проведении расширенных полевых испытаний пшеницы, планируемых в 2005-2006 гг.

Рис 8. Различие между двумя трансгенными линиями пшеницы (a, b) по высоте растений, наблюдаемое вследствие соматоклонального варьирования.

Грибковые болезни являются одним из главных биотических факторов снижающих урожайность пшеницы в России и др. странах. При этом обработка различными фунгицидами не является эффективным методом борьбы. Ранее в нашей лаборатории было показано, что экспрессия гена белка тауматина II (относится к классу PR-5 белков), увеличивает устойчивость растений земляники к Botrytis cynerea. Для увеличения грибковой устойчивости у российских сортов пшеницы мы работаем над суперэкспрессией генов нескольких тауматин-подобных белков выделенных из риса (TLP) и овса (oatpermI). В настоящий момент мы получили 21 линию трансгенной пшеницы сорта Андрос, в геноме которых подтверждено присутствие последовательностей генов TLP и outperm. После самоопыления этих линий мы получили более 160 растений поколения T1, из которых обобрано 30 гомозиготных семей по гену TLP и 7 гомозиготных семей по гену oatpermI. В настоящий момент мы проводим исследования на предмет увеличения устойчивости полученных растений к различным грибным патогенам пшеницы.

Рис 9. Авторы (Мирошниченко и Филиппов) на участке полевых испытаний пшеницы перед уборкой и просушиванием колосьев, август 2004 г.

Не менее актуальной проблемой современного зерноводства является засоление почв. Хотя засоление существовало задолго до появления человека, в результате развития интенсивного орошаемого земледелия эта проблема вышла на первый план во многих областях сельскохозяйственного производства. Сегодня около 20% всех культивируемых площадей в мире и около половины орошаемых земель подвержены засолению. Получение растений пшеницы устойчивых к высокому содержанию солей в почве позволит не только увеличить урожайность, но и расширит ареал её возделывания. В последние годы показано, что гены, кодирующие вакуолярные Na+ /H+ антипортеры, могут приводить к увеличению солевой устойчивости у трансгенных растений арабидопсиса, капусты, томата и риса. В настоящий момент мы проводим исследования по получению солеустойчивых трансгенных растений пшеницы методом переноса гена вакуолярного Na+ /H+ антипортера HNHX, клонированного из генома ячменя группой под руководством доктора А.В.Бабакова (Всероссийский Институт Сельскохозяйственной Биотехнологии РАСХН, г. Москва). По результатам баллистической трансформации получен ряд перспективных трансгенных линий Т0, гомозиготное потомство которых мы планируем протестировать к концу 2005 г на устойчивость к высоким концентрациям солей.


Список цитируемой литературы:

Baruah-Wolff J, Harwood, WA, Lonsdale DA, Harvey A, Hull R, Snape JW (1999). Luciferase as a reporter gene for transformation studies in rice (Oryza sativa L.). Plant Cell Rep 18, 715–720
Christensen AH, Sharrock RA and Quail PH (1992). Maize poly-ubiquitin genes: genes, structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplast by electroporation. Plant Mol Biol 18, 675–689
Duan X, Li X, Xue Q, Abo-El-Saad M, Xu D, Wu R (1996). Transgenic rice plants harboring an introduced potato proteinase inhibitor II gene are insect resistant. Nature Biotechnol, 14, 494–498
Fearing PL, Brown D, Vlachos D, Meghji M, Privalle L (1997). Quantitative analysis of CryIA(b) expression in Bt maize plants, tissues, and silage and stability of expression over successive generations. Mol Breed 3, 169–176
James VA, Avart C, Worland B, Snape JW and Vain P (2002 ). The relationship between homozygous and hemizygous transgene expression levels over generations in populations of transgenic rice plants. Theor Appl Genet 104, 553–561
McElroy D, Zhang W, Cao J and Wu R (1990). Isolation of an efficient actin promoter for use in rice transformation. Plant Cell 2, 163-171.
Peng J, Wen F, Lister RL, Hodges TK (1995) Inheritance of gusA and neo genes in transgenic rice. Plant Mol Biol, 27:91–104
Richards HA, Rudas VA, Sun H, McDaniel JK, Tomaszewski Z and Conger BV (2001). Construction of a GFP-BAR plasmid and its use for switchgrass transformation. Plant Cell Reports 20, 48 –54.